Artikkelit
(C) Samanaikainen adeniinin ja sytosiinin muokkaus kaksoisdeaminaasi CRISPR-jalkaeditorilla. (E) Järjestelmäeksonin ohitus ja (F) täyspitkän mRNA:n korjaus mutatoituvien DNA-sekvenssien avulla silmukointiakseptorisivustoilla. (G) Jalkaeditorin muokkaamien kudosten parantaminen poistamalla vähän muokattuja soluja käyttämällä tehokasta indusoituvaa Cas9:ää, jolla on samanlainen sgRNA kuin jalaeditorilla. (A) Eksonisen SNP:n lisääminen käyttämällä CRISPR/Cas9:ää ja alkuperäistä vapaata donoroligonukleotidia (ssODN) tai lineaarista dsDNA PCR -fragmenttia. (B) Intronisen SNP:n lisääminen käyttämällä Cas9-Jewel-, Cas9-CtIP- tai Cas9-DN1S-entsyymiä ja alkuperäistä ssODN:ää tai lineaarista dsDNA PCR -fragmenttia.
Bombastic casino: Mitkä ovat knockout-hiirten haitat?
- Kävelemällä yksi henkilö saapuu takaisin Philadelphiaan kuudennelta päivältä, koska Schwellenbach kärsi erityisen epäonnisen BABIPin.
- Kolmessa erillisessä määrityksessä elektroporasimme uuden K562 BCR/ABL -mobiilisarjan, jossa oli SDE-hABL-vaihe yksi ja Internet Explorer-hABL-1sgRNA.
- Tässä esimerkissä suurta CMV-promoottoria käytetään ohjaamaan valittavan geenin fraasi.
- Keskustelemme kriittisesti ohjelmistosta ja näet jokaisen strategian edut ja haitat.
Homologiaan perustuvaan menetelmään verrattuna, jossa voit tehdä muokkauksia Cas9:n katkaisukohdan 10 bp:n alueella, paras editori luo mutaatioita yli 29 bp:n etäisyyksillä Cas9n:n niskatulla alueella176. Täten täydellinen editori tarjoaa myös syvemmän keskittymisen vapauteen verrattuna homologiaan keskittyviin tekniikoihin. Ensinnäkin paras editori mahdollistaa kaikenlaisten substituutioiden, kuten muutosten, korjaamisen, transversiot ja lyhyet insertiot sekä deleetiot sen sijaan, että vaadittaisiin kaksisäikeisiä lomakatkoksia, muuten ulkoiset donor-DNA:n ratkaisumallit177,178. Ensisijainen muokkaus voi myös vastata jalan muokkausta esimerkiksi ei-toivotuissa sivullisen muokkauksissa, joissa useiden sytidiini- tai adeniiniemästen altistuminen jalan muokkausikkunassa176.
Menetelmät HDR-riippuvaisen CRISPR-Cas9-välitteisen genomin muokkaamisen lisäämiseksi
Uskomme, että CoTC-funktion lisääminen ei ainoastaan estä hypomorfisten alleelien esiintymistä, vaan voi myös lisätä reportterigeenin ilmentymistä tehostetun pre-mRNA:n toiminnan ja RNA:n vähäisemmän hajoamisen ansiosta. Kun vanha transgeeninen knockin-hiiri on tuotettu ilmentämään proteiinia, paljon tietoa voidaan löytää geenin poistamisesta ja/tai deleetiosta proteiinin toimivasta domeenista. Tämä voidaan saavuttaa satunnaisen mutaation avulla toksiinimutageneesin avulla, tai geeniansan avulla, tai geenin keskittymisen kautta, jolloin syntyy hyvä knockout-hiiri. Homologinen rekombinaatio antaa asiantuntijalle mahdollisuuden poistaa kokonaan yhden tai useamman eksonin hyvästä geenistä (katso ääriviiva 2), mikä johtaa hyvän mutatoituneen tai katkaistun proteiinin tai useammin nollan tarvittavan proteiinin tuotantoon. Uuden ulkoisen geenin ilmentyminen halutulla sivustolla varmistetaan varmistamalla uuden proteiinin ilmentyminen GLuc:sta poispäin (lisäkuva 5), ja voit laskea uuden lusiferaasi-intressin (kuvio 5).
Nyrkkeilyyrityssuunnitelma
Upouusi Braves meni mukavaan 2-0-johtoon, mutta kumpikaan ei onnistunut hyödyntämään tai hyödyntämään vain vähän tähänastisia suuria mahdollisuuksia, ja olisit jättänyt oven auki Phillylle, jopa Schwellenbachin maineesta huolimatta. Yksi kävely ja yksi vei joukkueen takaisin Phillyyn kuudennella vuoroparilla, kun taas Schwellenbach kärsi valitettavasta BABIP:stä. Joku pääsi ulos koriin, kun Schwellenbach teki Eli Whiten ohituspallon, josta tuli tuplamaali sydämeen kahdella strikeoutilla, ja hänellä oli loistava maaliton peli.
sgRNA-suunnittelussa sinun tulisi olla kaikkien mahdollisten kiinnostavasta osoitteestasi luotujen transkriptien syy (komitea A hyvä). Oman sgRNA:si on osoitettava eksoni, joka on suosittu kaikille tai joillekin kohdegeenisi silmukointiversioille. Yllä olevan analogian perusteella monille, jotka luovat indelin eksonissa 2, termin pois isoformista #dos, joten et saa koko geenisi knockout-menetelmää (komitea B). Kannattava knockout-yritys vaatii kuitenkin huolellista rakennetta ja aiot saavuttaa korkeimman kohdekiinnostuksen samalla minimoiden osoitteen ulkopuoliset seuraukset.
Ikeda ym. käyttivät tätä menetelmää arpettomien mutaatioiden tekemiseen pluripotenttien kantasolujen sisällä. Se mahdollisti solujen ryhmän, joka bombastic casino leikki magneettihelmillä, auttoi solujen lajittelua, jossa oli aktiivinen vasta-aine CD19:lle. Lisäksi mCherry-termin aste mahdollisti eristämisen bialleelisesti muokatuista soluista FACS:n avulla. Edellyttäen, että kaikki muokkausprosessit ovat tehokkaita eivätkä aiheuta ei-toivottuja mutaatioita, tämä menetelmä voi luoda lihaksia, joita voidaan muokata vain GOI:ssa. Vaikka näin ei olekaan, muutaman vaiheen tarve vähentää oikein muokatun lihaksen tuotantoa ja voi lisätä niiden aiheuttamiseen tarvittavaa tehoa. Samalla on mahdollista, että solut voivat poistaa valinnaisen markkerin lauseen seuraavasta vaiheesta indeleihin liittyvän knockout-poiston vuoksi tarkan muokkaamisen sijaan, vaikka tämä ei tapahdu uusissa 60-näytettyissä tapauksissa.
Adeniini ja sytosiini BaseEditing Antibiotic drug resistance examination Reporter (ACBE-ARSR) 72 parantavat ABE:n ja CBE:n suorituskykyä vaiheen 1.9 ja 4.6-kertaisesti, ja muokkaavan tehokkuuden on oltava 90 %. PEAR (ensisijainen muokkaavan toiminnan raportointi) on erinomainen työkalu ensisijaisten muokkaavien tapahtumien omaavien yksittäisten lihasten tunnistamiseen ja uuden muokatun populaation kasvattamiseen noin 84 %:sta 73. Koska uudet CRISPR-modifioidut kuplasolut muodostavat vain pienen osan ihmisistä, miten voimme valita, muokata ja jakaa tämän populaation?
Näin ollen geenin klassinen knockout-menetelmä ei voi koskaan johtaa siihen, että tutkimuslaitos luopuu hyvästä knockout-hiirikannasta ja siirtyy omaan tutkimukseen. Ehdollinen geenimuokkaus Cre-loxin ja Flp-frt-tekniikan avulla mahdollistaa uuden kiinnostuksen kohteena olevan geenin potkimisen pois vain suuresta osajoukosta kudoksia, muuten vain tiettynä päivänä, välttäen kuolleisuuden. Koska keskittyvää geeniä voidaan kontrolloida sekä paikallisesti että ajallisesti, varmistetun geenin toimintaa voidaan testata halutuissa puhelinmerkeissä tiettynä ajankohtana.
Kun tekoälyhämähäkit pelaavat jalkapalloa, kutsutaanko sitä edelleen "upeaksi nettipeliksi"?
Neljää alkiota, joilla on paljon mTagBFP2:ta ilmentäviä kudoksia, on kasvatettu aikuisuuden tukemiseksi ja ne voidaan risteyttää villityypin kalanruotosolujen tuottamiseksi. Yksi alkioista lähetti tehokkaasti uusimman kohdennetun insertion, joten sen lapset tuottivat vakaan alueen (25 %) (taulukko 1). Heterotsygoottiset F2-kalat lisättiin yhdessä, ja alkioille tehtiin -1 % metyyliselluloosamääritys 24 hvf20:n aikana. Villityypin ja heterotsygoottiset alkiot olivat fenotyyppisesti normaaleja hyvän metyyliselluloosamäärityskäsittelyn jälkeen; vaikka eivät, homotsygoottiset mutantit osoittivat vaurioituneita lihaksia, jotka fenokopioivat uuden, luodun bag3-mutanttifenotyypin (kuva 2d). QRT-PCR-tutkimus osoitti, että bag3-transkripti puuttuu bag3mTagBFP2-homotsygooteista (kuva 2e).
Samoin kuin TYR- ja Atm-geenien kohdalla, K562-kudoksista tehtiin noin kolme yksilöllistä elektroporaatiomääritystä, joissa kussakin oli ABL-eksonin ensimmäisen vaiheen sgRNA (SDE-hABL-1sgRNA ja Internet Explorer-hABL-1sgRNA) kloonattuina erinomaiseen CRISPR-Cas9-GFP-nisäkkäiden ilmentämisvektoriin. Sanger-sekvensointi osoitti genomiversion halutussa katkaisukohdassa jokaiselle sgRNA-sekvenssille, ja Tide-tutkimus ennusti useita erilaisia lyhyitä indelejä julkaisua kohden (kuvat 2 ja 3). NGS-tutkimus osoitti yleisimmät K562:ssa elektroporaation tuottamat alleelivariaatiot, jotka sisälsivät SDE- ja Internet Explorer-hABL-1-sgRNA:ita (S8-taulukko). 40 % (4/10) Internet Explorer-hABL-1-sgRNA:n luomista yksilöllisistä alleelivariaatioista johti kehyksen sisäisiin mutaatioihin. Vertailun vuoksi SDE-hABL-vaiheen 1 sgRNA tuotti 100 % (9/9) knockout-sekvenssejä, joista neljä (42,4 %) oli fyysisen tason mutaatioissa, mutta muuttuneella kanonisella silmukointijärjestyksellä (S8-taulukko).
Vaikka ei, jos kiinnostuksen kohteena oleva geeni on tärkeä, todellinen tyrmäys voi olla tappava, ja saatat mieluummin haluta tehdä täydellisen ehdollisen tyrmäyksen. Ennusta parhaita 5 kohdetta poispäin kohteista testattiin T7-endonukleaasi I:n (T7EI) epäsuhtautumiskatkaisumäärityksellä brändin standardien mukaisesti (Included DNA Technology) 28. Kohde-DNA-sekvenssit monistettiin PCR:stä spesifisten oligonukleotidien avulla (S12 Desk). Uusien heterodupleksikompleksien muodostamiseksi PCR-pisteet denaturoitiin 95 °C:ssa 10 minuutiksi, minkä jälkeen niitä sekoitettiin nopeasti lämpöramppitoiminnolla (95–85 °C, -2 °C/s ja 85–25 °C, 0,3 °C/s).